Remarques :

• dans l'opéron lactose on inclut parfois le gène lacI qui code le répresseur de l'opéron lactose ; en fait, il ne fait pas partie de l'opéron lui même : lacI est un gène simple (ne contenant qu'une seule ORF , et il n'est donc pas régulé comme l'opéron lactose ;

• les gènes Amp^R (qui code une béta- lactamase qui hydrolyse l'ampicilline et rend donc la bactérie insensible à cet antibiotique), Kan^R

  (contre la Kanamycine et d'autres aminosides), Tet^R (contre la tétracycline), etc. ; sont constitutifs et utilisés en génie génétique comme marqueurs de transformation et portés par la plupart des vecteurs plasmidiques utilisés.

Historiquement c'est l'étude de ce groupe de gènes par Jacob et Monod (prix Nobel) qui a permis pour la première fois de comprendre comment les gènes bactériens sont régulés.

Le cas des opérons lactose, saccharose, xylose, ...

Tant que le glucose est présent en abondance dans le milieu, il est inutile pour la cellule et très coûteux en énergie de produire des enzymes inutiles dans ce contexte (béta-galactosidase par exemple). Quand le glucose est abondant le taux d'AMPc dans le cytoplasme bactérien est très bas. Quand le glucose devient rare l'adénylate cyclase est activée et elle transorme de plus en plus d'ATP en AMPc. Ce métabolite est appelé second messager ; c'est une substance qui est produite dans la cellule en cas de stress métabolique (manque d'énergie). L'AMPc peut se fixer sur différentes protéines effectrices (qui font des choses) comme la protéine CAP. La protéine CAP activée par la fixation de l'AMPc se fixe alors en amont de différents promoteurs liés au catabolisme comme les opérons permettant l'utilisation d'oses (sucres) plus rares et complexes que le glucose. Par exemple, en amont de l'opéron lactose existe un site de fixation du complexe CAP+AMPc qui augmente d'un facteur 50 la transcription de l'opéron lactose, mais celui-ci n'est vraiment totalement actif qu'en présence d'un inducteur (allo-lactose ou bien en génie génétique l' IPTG qui en se fixant sur le complexe du répresseur (tétramère dela protéine codée par le gène lacI) le déforme et l'empèche de se fixer sur l'opérateur de l'opéron lactose. En d'autres termes l'inducteur (IPTG) inhibe l'inhibiteur (répresseur) ; moins moins égal plus ; la transcription a lieu quand l'inducteur empèche le répresseur de bloquer l'opérateur.

Le cas de l'opéron tryptophane

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Produire en trop grande quantité un acide aminé rare et complexe comme le tryptophane est trop coûteux en énergie, l'anabolisme du tryptophane nécessite la synthèse de cinq protéines différentes (5 enzymes). Á l'opposé du fonctionnement de l'opéron lactose (qui est lié au catabolisme), c'est quand il y a trop de tryptophane que l'opéron est réprimé.

Sources Wikipedia :

en français

en anglais (mieux !)

RT-PCR

N.B. : sera vu en deuxième année. En résumé :

• les ARN totaux doivent être purifiés, l'ADN génomique détruit par hydrolyse enzymatique (DNase) pour ne pas interférer avec les mesures.
• les ARNm sont transcrits en sens inverse en ADNc à l'aide d'une amorce d'ADN et d'une transcriptase inverse (ADN polymérase ARN dépendante) appelée en anglais RT;
• l'ADNc est amplifié lors d'une PCR quantitative en temps réel qui permet de mesurer la quantité d'ADNc, donc d'en déduire la quantité d'ARNm produit dans l'échantillon analysé. Un étalonnage est donc nécessaire.

Techniques basées sur l'hybridation moléculaire : utilisation de sonde

Marquage des sondes moléculaires en BMGG

Les sondes dites chaudes sont des sondes rendues radioactives par l'incorporation le plus souvent d'un phosphore 32 (isotope radioactif du phosphore noté ³²P) dans sa molécule. La révélation de la sonde se fera par autoradiographie ou par mesure de scintillation ; cette méthode très sensible est souvent remplacée par une méthode froide moins problématique ...

Les sondes dites froides sont marquées :

• soit par un ligand détectable : antigène ou biotine ; une molécule reconnaîtra spécifiquement ce ligand et sera soit fluorescente, soit liée à une enzyme chromogénique.
• soit directement à un fluorochrome (cf. FISH painting), soit directement à une enzyme chromogénique ou luminogénique.

Comparaison Western et Northern Blot

La technique inventée par le docteur Southern pour détecter une séquence spécifique au sein d'un mélange de fragments d'ADN fut adaptée respectivement à :

• la détection d'une séquence d'ARN au sein d'un mélange de molécules d'ARN de tailles différentes ; cette technique est appelée Northern Blot
• la détection d'une protéine au sein d'un mélange de protéines de tailles différentes ; cette technique est appelée Western Blot

points communs

Southern, Northern, et Southern Blot partagent trois étapes :

1. la première consiste à séparer les molécules du mélange par électrophorèse ;
2. la seconde consiste à transférer les molécules du gel vers une membrane qui fixe les molécules sans changer leur position relatives dans le gel ; ce trasfert se fait soit par capillarité soit par électrophorèse perpendiculaire ...
3. la dernière consiste à révéler la présence des cibles recherchées après avoir saturé la membrane dans ses sites non spécifiques pour éviter des faux positifs ; cette dernière étape necéssite de nombreux lavages à chaque étape pour éliminer les molécules fixées non spécifiquement (évite les bruits de fond).

différences